Nuôi trồng và xác định thành phần amino acid của một số loài nấm bào ngư (Pleurotus spp.) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC

iv
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm ta i
Tóm tắt ii
Mục lục iii
Danh sách các chữ viết tắt vi
Danh sách các hình vii
Danh sách các bảng viii
1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích 2
1.3. Yêu cầu
1.4. Nội dung thực hiện 2
2. TỔNG QUAN 3
2.1. Nấm trồng 3
2.1.1. Khái niệm về nấm 3
2.1.2. Sinh sản và chu trình sống 5
2.1.3 Đặc điểm biến dƣỡng và sinh lý 7
2.2. Nấm bào ngƣ 8
2.2.1. Giới thiệu 8
2.2.2. Một số loài nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng ở VIệt Nam 9
2.2.2.1. Nấm bào ngƣ Pleurotus florida 10
2.2.2.2. Nấm bào ngƣ Pleurotus sajor-caju 10
2.2.2.3. Nấm bào ngƣ Pleurotus pulmonarius 11
2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus 11
2.3. Phƣơng pháp sắc ký 12
2.3.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký 12
2.3.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký 12
2.4. Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tich amino acid 13

v
2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatography) 13
2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC) 14
2.4.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 15
2.4.3.1. Pha tĩnh 15
2.4.3.2. Pha động 16
2.4.3.3. Bộ dụng cụ HPLC 16
2.5. Các bƣớc phân tích amino acid 17
2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis) 17
2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) 19
2.5.3. Phân tách trên HPLC 20
2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu 21
2.4.4.1. Định tính 21
2.4.4.2. Định lƣợng 21
2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ 23
3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 23
3.1.1. Thời gian thực hiện 23
3.1.2 .Địa điểm 23
3.1.3.Vật liệu nghiên cứu 23
3.2. Hóa chất và dụng cụ 23
3.2.1. Hóa chất 23
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị 24
3.3. Phƣơng pháp nhân giống và trồng nấm 24
3.3.1. Môi trƣờng 24
3.3.2. Phƣơng pháp 24
3.2.2.1. Chuẩn bị môi trƣờng PGA 24
3.2.2.2. Chuẩn bị môi trƣờng hạt 24
3.3.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng giá môi 25
3.2.2.4. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi trồng 25
3.2.2.5. Tóm tắt quy trình 26
3.3.3. Phân tích amino acid 26
3.3.3.1.Thủy phân mẫu 26

vi
3.3.3.2. Tạo dẫn xuất: 27
3.3.3.3. Phân tích HPLC 28
3.3.3.4. Phân tích và tính toán kết quả 28
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
4.1. Kết quả 29
4.1.1. Kết quả trồng nấm 29
4.1.1.1. Sự tăng trƣởng của hệ sợi trên các môi trƣờng 29
4.1.1.2. Sự hình thành quả thể 30
4.1.2. Kết quả phân tích amino acid 32
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35
5.1. Kết luận 35
5.2. Đề nghị 35
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 36



















vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN:Acetonitril
HPLC: High performance liquid chromatography
TLC: Thin layer chromatography
PITC: phenylisothiocyanate
PTC: phenylisocarbamyl
TEA: Triethylamine.
























viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH


HÌNH TRANG
Hình 2.1. Cấc trúc tế bào nấm 3
Hình 2.2. Chu kỳ sống của nấm đảm 6
Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius 11
Hình 2.4. Pleurotus abalonus 11
Hình 2.5 Pleurotus sp 11
Hình 2.6. Pleurotus floridanus 11
Hình 2.7. Mô hình sắc ký giấy 14
Hình 2.8. Mô hình sắc ký lớp mỏng 14
Hình 2.9. Bộ dụng cụ HPLC 16
Hình 2.10. Thủy phân protein bằng HCl 18
Hình 2.11. Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC 20
Hình 2.12. Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus sp bởi sắc ký giấy tròn 22
Hình 4.1. Sinh trƣởng trên môi trƣờng hạt của Pleurotus floridanus, Pleurotus
flabellatus, Pleurotus flabellatus 31
Hình 4.2. Pleurotus abalonus trên giá mô 31
Hình 4.3. Bào tử Pleurotus abalonus 31
Hình 4.4. Bào tử đảm Pleurotus floridanus 31
Hình 4 .5. Bào tử đảm Pleurotus abalonus 31
Hình 4.6. Quả thể nấm Pleurotus floridanus 32
Hình 4.7. Quả thể nấm Pleurotus abalonus 32
Hình 4.8 Quả thể nấm Pleurotus flabellatus 32
Hình 4.9 Quả thể nấm Pleurotus pulmonarius 32







ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Nhiệt độ thích hợp đối với một số nấm bào ngƣ 10
Bảng 2.2. Các dạng sắc ký cơ bản 13
Bảng 4.1. Thời gian lan tơ đầy thiết bị của các dòng nấm 29
Bảng 4.2. Đặc tính quả thể của các dòng nấm 30
Bảng 4. 3. Thành phần amino acid trên Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus 33


1
Phần 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, nấm bào ngƣ đang dần trở thành một trong những khẩu phần chính
trong bữa ăn của ngƣời dân. Bên cạnh mùi vị thơm ngon, giàu dinh dƣỡng, rất dễ chế
biến, nấm còn đƣợc xem nhƣ là một loại “rau sạch” và có giá trị dƣợc liệu. Sản lƣợng
nấm bào ngƣ tăng lên rất nhanh trong vài thập kỷ qua. Theo thống kê của Chang và ctv
(1999) chỉ trong vòng 36 năm trở lại đây tổng sản lƣợng nấm trồng tăng gấp 21 lần từ
350.000 năm 1965 tăng lên 7,5 triệu tấn, trong đó nấm bào ngƣ Pleurotus spp. tăng từ
169000 tấn năm 1986 lên 876000 tấn năm1997.
Gần đây, Việt Nam cũng đang phát triển công nghệ trồng nấm trong nƣớc. Vì
thế, ngoài việc khai thác nấm hoang dại đem về trồng, nƣớc ta còn nhập khẩu nhiều
loại nấm bào ngƣ khác từ nƣớc ngoài nhƣ Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản. Trong số
đó, có một số loài đã đƣợc biết rất rõ về thành phần dinh dƣỡng, một số loài còn lại
thành phần này vẫn chƣa đƣợc công bố chính thức, đặc biệt là thành phần amino acid.
Vì thế, việc xác định thành phần amino acid trên nấm bào ngƣ đối với Việt Nam là
điều cần thiết để có thể đánh giá giá trị sinh học, cũng nhƣ so sánh sự khác nhau giữa
chúng. Từ xƣa đến nay, việc xác định amino acid đã đƣợc thực hiện trên rất nhiều
công cụ khác nhau nhƣ: sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng. Phân tích amino acid trên các
công cụ phân tích truyền thống này thì đòi hỏi nhiều thời gian và rất phức tạp.
Ngày nay, với sự phát triển của kỹ thuật phân tích, việc xác định thành phần
amino acid trong mẫu sinh hóa đã đƣợc đơn giản hơn rất nhiều, bởi hầu hết các công
cụ đã đƣợc tự động hóa và đƣợc nối trực tiếp bộ phận xử lý số liệu. Hiện nay, trên thị
trƣờng đang tồn tại rất nhiều kỹ thuật phân tích amino acid nhƣ: sắc ký lỏng cao áp,
HPLC (high performance liquid chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange
chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis).
Trong phạm vi cho phép, chúng tôi chỉ thực hiện “Phân tích amino acid bằng
sắc ký lỏng cao áp” trên một số loài nấm đang có ở thị trƣờng Việt Nam. Từ đó, với
kết quả thu đƣợc chúng tôi sẽ tiến hành so sánh với các đối tƣợng khác cũng nhƣ sự
khác nhau giữa chúng và dữ liệu về thành phần amino acid của từng loài nấm bào ngƣ
sẽ đƣợc lƣu lại để làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này.


2



1.2. Mục đích
So sánh sự thành phần amino acid giữa các loài nấm bào ngƣ đang có trên thị
trƣờng Việt Nam. Khi đó, chúng tôi sẽ chọn ra một loài phù hợp để so sánh thành phần
amino acid khi trồng trên các cơ chất khác nhau

1.3. Yêu cầu
Tạo đựợc mẫu có độ tinh sạch cao.
Tránh hiện tƣợng làm thay đổi tính chất mẫu nhƣ oxy hóa, halogen hóa, hay
làm mẫu bị hủy hoàn toàn trong quá trình thủy phân.
Sử dụng thiết bị HPLC (high performance liquid chromatography) của Trung
tâm Phân Tích Hóa Lý để phân tích thành phần amino acid của các loài nấm kể trên

1.4. Nội dung thực hiện
Thu thập và nhân giống các loài nấm đang có trên thị trƣờng.
Nuôi trồng các loài nấm này trên môi trƣờng mùn cƣa có bổ sung một số vi lƣợng.
Tiến hành thu quả thể
Xác định thành phần amino acid trên các loài nấm bào ngƣ bằng sắc ký lỏng
cao áp (HPLC).

















3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Nấm trồng
2.1.1. Khái niệm về nấm
Hiện nay, số loài nấm trồng đƣợc chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong số nấm ăn
thiên nhiên. Ngoài đặc điểm chung là quả thể hay tai nấm có kích thƣớc lớn (đa số
dạng tán dù), chúng còn ăn ngon và rất giàu dinh dƣỡng [5].
Nấm rất phong phú và đa dạng, bao gồm cả những loại ăn đƣợc và không ăn
đƣợc, những loài cho quả thể lớn có thể thấy bằng mắt thƣờng và những loài phải sử
dụng kính hiển vi mới quan sát đƣợc [5].
Ban đầu nấm đƣợc xếp vào giới thực vật. Tuy nhiên, quan điểm này ngày nay
không còn thuyết phục nữa và nhiều nhà phân loại học đã đề nghị xếp nấm vào một
giới riêng, gọi là giới nấm. Sở dĩ xếp Nấm thành một giới riêng mà không xếp vào giới
Thực vật vì nấm không có lục lạp, không có sắc tố quang hợp, không có đời sống tự
dƣỡng nhƣ thực vật, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn
không chứa cellulose trong thành tế bào [1].

Lysosome
Thành tế bào Màng tế bào chất
Bộ máy golgi
Nhân
Ti thể
Mạng lƣới nội chất
Ribosome
Hình 2.1. Cấc trúc tế bào nấm (Nguyên Lân Dũng, 2001)


4
Nấm ăn có cấu tạo chủ yếu là hệ sợi nấm. Các sợi nấm ăn có dạng ống tròn.
Các ống này đều có vách ngăn. Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty (hypha), hệ sợi nấm còn
gọi là khuẩn ty thể (mycelium). Khoảng cách giữa hai vách ngăn gọi là tế bào. Tế bào
nấm có những đặc trƣng riêng, khác biệt với tế bào động vật và thực vật. Trƣớc hết là
thành tế bào. Dƣới kính hiển vi điện tử có thể quan sát thấy thành tế bào cấu tạo bởi
nhiều lớp. Nếu nhƣ thành tế bào của thực vật cấu tạo chủ yếu bởi cellulose thì thành tế
bào của những nhóm nấm khác nhau lại có cấu tạo bởi những thành phần khác nhau.
Hầu hết các loài nấm đảm đều có thành tế bào cấu tạo chủ yếu bởi kitin- glucan. Thông
qua các lỗ trên vách ngăn, chất nguyên sinh có thể di chuyển dễ dàng trong sợi nấm.[1].
Trong tế bào sơi nấm khi quan sát dƣới kính hiển vi quang học phóng đại từ
1000 đến 1500 lần (Hình 2.1) có thể thấy
Màng tế bào
Nhân tế bào
Bộ máy golgi
Ribosome
Lysosome
Ti thể
Mạng lƣới nôi chất.
Sợi nấm có thể phát triển từ bào tử hay tử một đoạn sợi nấm. Bào tử nảy mầm
theo nhiều hƣớng khác nhau, sợi nấm phân nhánh nhiều lần, tạo nên một hệ sợi chằng
chịt và thƣờng có màu trắng.
Riêng ở nấm đảm nói chung thƣờng có tới 3 cấp sợi nấm. Sợi nấm cấp một (sơ
sinh), sợi nấm cấp hai (thứ sinh) và sợi nấm cấp ba (tam sinh). Sợi nấm cấp một lúc
đầu không có vách ngăn và có nhiều nhân, dần sẽ tạo thành vách ngăn và phân thành
nhiều tế bào đơn nhân trong sợi nấm. Sợi nấm cấp hai đƣợc tạo thành do sự phối trộn
của hai sợi nấm cấp một. Khi đó nguyên sinh chất trong hai sợi nấm sẽ phối trộn với
nhau. Hai nhân vẫn đứng riêng rẽ làm cho tế bào có hai nhân. Ngƣời ta còn gọi sợi
nấm loại này là sợi nấm song nhân (dycaryolic hyphae). Sợi nấm cấp ba là do sợi nấm
cấp hai phát triển thành. Các sợi nấm này liên kết chặt chẽ với nhau và
tạo thành quả thể [1].

Xem chi tiết: Nuôi trồng và xác định thành phần amino acid của một số loài nấm bào ngư (Pleurotus spp.) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC