Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizotonia solani gây bệnh khô vẳn lúa

v
SUMMARY
Nguyen Thi Minh Thu, Nong Lam university, Ho Chi Minh city, 8/2007. “Use
RAPD analysis study genetic diversity of Rhizoctonia solani population
pathogenic sheath blight in rice”.
Sheath blight caused by R. solani is an important disease on rice. This disease
is cause of serious damage in rice crop. Chosing assistant plant culture and
building strategy against this fungi is very difficult because of genetic diversity of
R. solani isolates. So, study genetic diversity is the fisrt step to know about this
fungi.
Therefore, 17 R. solani isolates were recognized from several diffirent
provinces were extracted total DNA and realize RAPD reaction with three primer
OPL-05, OPL-08, OPM-13. Analysis RAPD data by NTSYSpc software was
divided 17 isolates place into two group. Rate genetic similarity of these analysis
isolate was a range from 53 to 89% . Information of study could enhance
knowledge about genetic of R. solani isolates and to basis to build a method
against fungi effect and safe for environment.















vi
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Trang bìa
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Summary v
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt ix
Danh sách các hình x
Danh sách các bảng xi
Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài 2
1.2.1. Mục tiêu 2
1.2.2. Yêu cầu đề tài 2
1.3.Giới hạn của đề tài 2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1.Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani 3
2.1.1.Đặc điểm hình thái 3
2.1.2. Đặc điểm sinh lý 4
2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy 5
2.1.4. Phạm vi kí chủ của nấm Rhizoctonia solani 5
2.1.5. Sự phân nhóm của nấm Rhizoctonia solani 6
2.2. Bệnh khô vằn hại lúa do nấm Rhizoctonia solani gây ra 6
2.2.1. Triệu chứng bệnh 7
2.2.2. Điều kiện phát sinh và phát triển bệnh 7

vii
2.2.3. Phòng chống bệnh khô vằn 8
2.3. Các phƣơng pháp thƣờng dùng trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền 9
2.3.1. Phƣơng pháp RFLP (Retriction Fragment Length Polymorphism) 9
2.3.2. Phƣơng pháp AFLP (Amplified fragment length polymorphism) 10
2.3.3. Microsatellite 11
2.3.4. Phƣơng pháp RAPD (Random Amplification Polymorphism DNA) 11
2.3.4.1. Giới thiệu kỹ thuật RAPD 11
2.3.4.2. Một số vấn đề thƣờng gặp khi thực hiện phản ứng RAPD 12
2.3.4.3. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD 13
2.3.4.4. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD 13
2.3.4.5. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD 13
2.3.4.6. Những cải tiến của kỹ thuật RAPD 14
2.4. Các kết quả nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani. 14
2.4.1. Những nghiên cứu trong nƣớc 14
2.4.2. Những nghiên cứu ở nƣớc ngoài. 15
Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16
3.1. Thời gian và địa điểm 16
3.2. Vật liệu nghiên cứu 16
3.2.1. Nguồn nấm 16
3.2.2. Những hoá chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 16
3.2.2.1. Những hóa chất sử dụng để li trích DNA 16
3.2.2.2. Những hoá chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD 16
3.2.2.3. Những hoá chất sử dụng để điện di sản phẩm RAPD 18
3.2.3. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 18
3.2.3.1. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong li trích 18
3.2.3.2. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong phản ứng RAPD 18
3.2.3.2. Các dụng cụ và thiết bị dùng trong điện di 18
3.3. Phƣơng pháp tiến hành 19
3.3.1. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani 19

viii
3.3.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 19
3.3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát số lƣợng chu kì phản ứng 20
3.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ hoá chất lên phản
ứng RAPD 21
3.3.3. Thực hiện phản ứng RAPD 23
3.3.4. Điện di sản phẩm RAPD 23
3.3.5. Phân tích kết quả RAPD 23
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1. Kết quả li trích DNA tổng số của nấm R. solani 24
4.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 25
4.2.1. Lƣợng DNA mẫu 25
4.2.2. Khảo sát chu kì phản ứng 26
4.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD 26
4.3. Phản ứng RAPD của các dòng phân lập nấm R. solani 29
4.4. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani 32
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37
5.1. Kết luận 37
5.2. Đề nghị 37
PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 38
PHẦN 7: PHỤ LỤC 41








ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified fragment length polymorphism
PDA Potato dextrose agar
R. solani Rhizoctonia solani
RAPD Random amplification polymorphism DNA
RFLP Retriction fragment length polymorphism
SSR Simple sequense repeat
VNTR Variable number tandem repeat



















x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1. Bệnh khô vằn trên cây lúa 6
Hình 4.1. Ảnh điện di DNA tổng số của các dòng phân lập nấm R. solani 24
Hình 4.2. Ảnh điện di DNA của các dòng phân lập nấm R. solani sau khi pha
loãng 25
Hình 4.3.Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L651 với primer OPM-08 ở
các số chu kì khác nhau của qui trình nhiệt 26
Hình 4.4.Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L66 và primer OPL-05 với
các nồng độ MgCl
2
và primer khác nhau 27
Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L66 và primer OPL-05 với
các nồng độ DNA mẫu và Taq khác nhau 28
Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với
primer OPM-13 29
Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với
primer OPL-05 30
Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với
primer OPL-08 30
Hình 4.9. Sơ đồ phân nhóm (dendrogram) của 17 dòng phân lập nấm R. solani dựa
trên sản phẩm RAPD với 3 primer OPM-13, OPL-05, OPl-08 32
.





xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 3.1.Kí hiệu và địa điểm thu thập 17 dòng phân lập nấm R.solani đƣợc dùng
trong nghiên cứu 17
Bảng 3.2. Tên và trình tự các primer dùng trong nghiên cứu 17
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD 20
Bảng 3.4. Thành phần hoá chất đƣợc sử dụng trong phản ứng RAPD 20
Bảng 3.5. Bảng thành phần hoá chất dùng trong thí nghiệm 1 21
Bảng 3.6. Bảng thành phần hoá chất dùng trong thí nghiệm 2 22
Bảng 4.1. Thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD đƣợc sử dụng để khảo sát sự
đa dạng di truyền của nấm R. solani 29
Bảng 4.2. Ma trận tỷ lệ tƣơng đồng di truyền (%) giữa 17 dòng phân lập nấm R.
solani dựa trên sản phẩm RAPD với 3 primer OPL-05, OPL-08, OPM-13 33
Bảng 7.1. Số liệu mã hoá của sản phẩm phản ứng RAPD trƣớc khi xử lí bằng phần
mềm NTSYS 41














1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Rhizoctonia solani Kühn là loài nấm quan trọng nhất của nấm Rhizoctonia
và cũng là nguyên nhân gây ra bệnh khô vằn lúa. Hiện nay, nấm R. solani đang gây
bệnh khô vằn lúa trên khắp lãnh thổ Việt Nam gây ra nhiều thiệt hại nghiêm trọng.
Nấm R. solani không chỉ gây bệnh trên cây lúa mà còn gây nhiều bệnh trên
các cây trồng khác nhƣ đậu xanh, đậu nành, mía, khoai tây, lúa miến và trên một số
loài cây ăn quả. Không những thế, R. solani còn kí sinh đƣợc trên cả các loài cỏ nhƣ
cỏ chỉ, cỏ ống, cỏ linh lăng, cỏ lồng vực…
Phòng trừ bệnh này bằng biện pháp luân canh hiện nay không có hiệu quả
do phổ kí chủ quá rộng của nấm R. solani. Bên cạnh đó, sự đa dạng di truyền của
nấm gây khó khăn cho việc sàng lọc các giống kháng. Việc phòng trừ nấm bằng hoá
chất thì cho hiệu quả khá cao, tuy nhiên, phƣơng pháp này lại gây hại cho môi
trƣờng đồng thời cũng ảnh hƣởng xấu đến tính an toàn của sản phẩm lúa gạo.
Để có thể kiểm soát bệnh khô vằn lúa do R. solani gây ra thì cần phải hiểu
về cấu trúc quần thể của các dòng phân lập nấm R. solani. Bƣớc đầu tiên để có thể
hiểu đƣợc cấu trúc quần thể là cần phải hiểu về sự đa dạng di truyền của R. solani
bởi sự đa dạng di truyền phản ánh lịch sử tiến hoá và tiềm năng tiến hoá của quần
thể.
Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử hiện nay, nhiều phƣơng
pháp đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của các loài nấm bệnh
nói chung và R. solani nói riêng nhƣ RFLP, RAPD, AFLP…….Trong những kỹ
thuật đƣợc sử dụng, RAPD đƣợc xem là kỹ thuật có nhiều ƣu điểm do rẻ tiền,
nhanh, nhạy, cần lƣợng mẫu ít và không cần biết trình tự DNA của loài cần nghiên
cứu. Do những ƣu điểm đó nên RAPD đã đƣợc chọn để thực hiện đề tài này.
Với mong muốn đƣợc hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của các dòng
phân lập nấm R. solani gây bệnh trên lúa, nhằm cung cấp thêm thông tin để xây


2
dựng biện pháp quản lí nấm một cách hữu hiệu, chúng tôi thực hiện đề tài : “ Sử
dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizoctonia
solani gây bệnh khô vằn lúa”.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu
Khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô
vằn hại lúa, cung cấp thông tin để tăng thêm sự hiểu biết về di truyền của nấm R.
solani và làm cơ sở cho việc xây dựng các biện pháp phòng trừ nấm hiệu quả và an
toàn cho môi trƣờng.
1.2.2. Yêu cầu của đề tài
Li trích DNA của các dòng phân lập nấm R. solani
Tối ƣu hoá qui trình nhiệt và thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD.
Dùng phƣơng pháp RAPD để khảo sát sự đa dạng di truyền của dòng nấm
R. solani.
1.3. Giới hạn của đề tài
Đề tài chỉ đƣợc thực hiện với 3 primer ngẫu nhiên và 17 dòng nấm phân
lập (isolate) R. solani.














3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về nấm Rhizoctonia solani
Nấm Rhizoctonia solani là một nhóm nấm lớn rất đa dạng và phức tạp.
Giai đoạn vô tính, R. solani thuộc bộ nấm trơ Mycelia steliria, lớp nấm bất toàn
Fungi imperfecti (theo Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998). Giai đoạn hữu tính
nấm có tên là Thanatephorus cucumeris, thuộc họ Ceratobasidiaceae, bộ
Ceratobasidiales, ngành Basidiomycota.
R. solani thƣờng tồn lƣu dƣới dạng sợi nấm và hạch nấm trên tàn dƣ thực
vật và trên đồng ruộng. Bào tử hữu tính hiếm khi gặp trên cây bệnh.
Trƣớc đây, Pellicularia filamentosa và Corticium solani là tên đƣợc sử
dụng cho loài nấm này.
2.1.1. Đặc điểm hình thái
Ở giai đoạn vô tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch. Sợi nấm khi còn
non không màu, khi già chuyển sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu. Sợi nấm đa
bào, có đƣờng kính từ 8 - 13µm, phân nhánh tƣơng đối thẳng góc, chỗ phân nhánh
hơi thắt lại, và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê
Lƣơng Tề, 1998). R. solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm
phân nhánh (lobate hyphae) và các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells) (dẫn theo
Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005).
Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch. Đặc điểm của hạch rất hay
thay đổi. Hạch nấm khi còn non có màu trắng nhƣng khi về già có thể có màu nâu,
nâu đen, nâu xám và trên vỏ có lông. Hạch nấm có hình dạng phức tạp, đôi khi hình
cầu, đáy phẳng, bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Đƣờng Hồng Dật, 1976).
Đƣờng kính hạch nấm từ 1- 6 mm. Từng hạch nấm có thể liên kết lại với nhau tạo
thành hạch nấm to (Ou, 1983). Hạch nấm khi còn non có thể chìm dƣới nƣớc nhƣng
khi già nổi lên do tế bào phía ngoài hạch trở nên rỗng (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến
Sỹ, 2005).

Xem chi tiết: Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizotonia solani gây bệnh khô vẳn lúa