found.,Error! Reference source not found. Error! Reference source not found.,Error! Reference source not
found.,Error! Reference source not found.)
. MS analysis was performed on instrument
mass spectrometer at laboratory of Angers University. Mode ESI + and
mode ESI – was performed and recorded in the range of m/z (amu) in the
full scan acquisition mode. Nuclear magnetic resornance (NMR)
1
H,
13
C,
DEPT, the 2D NMR spectra HMQC, HMBC were recorded.
Results: investigation on rhizomes by GC and TLC reveals that the major
essential oil constituents of rhizomes collected from Quang Nam are similar
to other species of genus curcuma. The
1
H-nmr and IR showed compounds
in cyclohexane extract contained moieties in serquiterpene, serquiterpene
lactone structure of other curcuma essential oil constituents. The ethyl
acetate extract was chromatoghraphed on silica gel column with nomal
phase, The fraction were purified by TLC preparative, analyzed
1
H-nmr,
13
C-nmr, DEPT, HMQC, HMBC, MS, IR, HPLC showed structures of diaryl
heptanoids group, especially, there are structures which have never been
published for curcuma species.
Conclusion: The majority of essential oil constituents of rhizomes collected
from Quang Nam are similar to essential oil constituents of other species of
genus curcuma. Fraction was purified by TLC preparative, In result the
products contained diaryl heptanoids constituents. 3,5-dihydroxy-1,7-bis(4-
hydroxyphenyl)heptane and its derivatives found in this research revealed
that cytotoxic activity of rhizome come from one of these components.
Especially, discovery of 3,5-dihydroxy-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)heptane
and its derivatives in ethyl acetate extract and methanol extract was matched
with cytotoxic activity of these extracts found. Further more, these aryl
heptanoids were also found in family gingiberaceae, in some genus alpina.
However, 3,5-dihydroxy-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)heptane has not been
found in known-specices of curcuma.
Key words: Diaryl heptanoids, Curcuma, Gingiberaceae
ĐẶT VẤN ĐỀ
Họ gừng Gingiberaceae gồm 52 giống và hơn 1300 loài phân bố khắp vùng
nhiệt đới Nam phi, châu Á và châu Mỹ. Ở Việt Nam, 19 loài curcuma đã
được tìm thấy
(5)
trong tổng số hơn 116 loài đã biết.
Nhiều loài thuộc giống alpina hoặc giống curcuma của họ gừng là những
dược liệu quan trọng. Giống curcuma được xác định và đặt tên bởi Linnaeus
năm 1753 (Carl Von Linne’1707 – 1778)
(Error! Reference source not found.)
. Có nhiều
loại củ giống curcuma đóng vai trò quan trọng trong y học, đã được dùng
làm thuốc cổ truyền ở Trung quốc, Nhật và Đông nam châu Á vì những tác
dụng hữu ích của chúng, như tác dụng kháng ung thư, kháng ung bướu, giảm
cholesterol, chống oxi hoá, kháng viêm, kháng virus gây suy giảm miễn dịch
ở người
(2,6,8,11,18,20,21,Error! Reference source not found.)
. Nghệ đã cho thấy tác dụng
kháng khuẩn chống lại chủng Staphylococcus Aureus đề kháng methicilline
(MRSA)
(19)
, cấu trúc hoá học diarylheptanoids đã cho thấy hoạt tính chống
ung thư, sự chống lại tế bào human promyelocytic leukemia HL-60, HSC-2
và (HGF)
(Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.)
.
Mục tiêu: Nghiên cứu này xác định thành phần hoá học có hoạt tính sinh
học trên bốn loại dịch chiết, được chiết từ củ thuộc họ gừng bằng bốn loại
dịch chiết là Cyclohexane, Dichloromethane, Ethyl acetate and Methanol.
Củ thuộc họ gừng được thu hoạch tại Miền Trung Viet Nam. Củ này đã
được dùng như là thuốc nam trị bệnh ung bướu đã cho kết quả tốt, dịch chiết
của củ đã được nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư tại Cộng Hoà Pháp và đã
cho thấy kết quả dịch chiết củ thuộc họ gừng này có tác dụng kháng ung thư
(cytotoxic). Hơn nữa, Diarylheptanoids từ Pericarps of Juglans Cathayensis
Dode có tác dụng kháng ung thư đã được nghiên cứu và được công bố
(Error!
Reference source not found.)
.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dược liệu, củ thuộc họ gừng thu hái ở Miền Trung Việt Nam được sắt lát
mỏng, làm khô và chuyển sang Pháp theo đường hàng không.
Chiết dược liệu, củ được nghiền thành bột mịn, được nhồi vào cột và được
chiết bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần cyclohexane,
dichloromethane, ethyl acetate, methanol ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Dịch
chiết được bay hơi dưới áp suất giảm trên máy Genevac Z nhiệt độ phòng,
khối lượng cắn được cân và bảo quản
ở 4 0C.
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng nhôm Kieselgel 60
F
254
(dày 0.25 mm, 20 x 20 cm) Merck, Germany, vết được phát hiện bằng
đèn UV (254 nm).
Sắc ký lớp mỏng điều chế (TLC Prep.) được thực hiện trên tấm thuỷ tinh
silica gel 60 F
254
glass plates (20 x 20 cm), Merck Germany.
Phân tích tinh dầu bằng sắc ký khí (GC) được chạy trên máy Aligent
6890 series GC system và Aligent 7683 series injector. Điều kiện tách sắc
ký: cột mao quản silica (30 m x 0.32 mm, film dày 0.25 µm). nhiệt độ buồng
nung từ 70
0
C to 120
0
C sự tăng nhiệt độ 5
0
C/min và nhiệt được giữ ở 120
0
C trong 25 min, và 120
0
C tới 180
0
C sự tăng nhiệt độ 5
0
C/min và nhiệt độ
được giữ tại 180
0
C cho 16 min. khí mang hydrogen, nitrogen. Tỉ lệ 1:10. thể
tích tiêm 0.1 µm.
Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được thực hiện bằng cột C18
cột pha đảo, pha động bao gồm hệ dung môi A (nước chứa 0.05% v/v formic
acid) và dung môi B (acetonitril). Chương trình rửa giải khởi đầu bằng tỉ lệ
hệ dung môi A:B = 100:0 thay đổi đến A:B = 0:100 trong 40 phút. Tốc độ
dòng 1 mL/min và xác định với detector ở 280 nm.
(Error! Reference source not found.)
Phân tích phổ khối lượng (MS) được thực hiện trên máy phổ khối lượng
tại phòng thí nghiệm SCAS của Đại học Angers, cộng hoà Pháp. Kỹ thuật
xác định phổ khối mode ESI + and mode ESI – được sử dụng để xác định và
kết quả được ghi bằng đơn vị m/z (amu).
Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy quang phổ Brucker Vector 22 ( =
633 nm), tại phòng thí nghiệm SONAS khoa Dược, Đại học Angers, Cộng
hoà Pháp.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (NMR)
1
H, carbon
13
C và phổ DEPT
được đo trên máy 270 MHz, Jeol JNM-GSX 270 WB FTNMR System.
Chuyển dịch hoá học được đo bằng giá trị δ ppm, với chất chuẩn so sánh
tetramethylsilan (TMS). Dung môi hoà tan chất được chạy phổ NMR là
CDCl
3
, CD
3
OD được sản xuất bởi công ty Merck.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR spectra, HMQC,
HMBC) được đo trên máy Brucker AVANCE DRX, tần số 500 MHz tại
phòng thí nghiệm SCAS của Đại học Angers. Tất cả các mẫu đo có thể tích
600 µL trong ống chuẩn đường kính 5 mm, tại 20
0
C.
KẾT QUẢ
Củ dược liệu thuộc họ gừng được nghiền thành bột mịn (500 g), được chiết
lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần cyclohexane,
dichloromethane, ethyl acetate và methanol, tại nhiệt độ phòng. Dịch chiết
được cô dung môi bằng máy cô dưới áp suất giảm Evaporator Genevac Z-2
thu được 16 g cắn từ dịch chiết cyclohexane, 9.7 g cắn từ dịch chiết
Dichloromethane, 2.9 g cắn từ dịch chiết ethyl acetate, 24 g cắn từ dịch chiết
methanol.
Cắn cychlohexane (5 g) được hấp phụ vào trong cột silica gel cột 1 (C1)
(Hình 1), dùng hệ dung môi pha động lần lượt là (cyclohexane, cyclohexane:
ethyl acetat, ethyl acetat : methanol) để rửa giải. Thu được các phân đoạn,
trong đó phân đoạn từ F1 đến F155 màu sắc thay đổi từ hồng đến vàng, tím,
hơi nâu, hơi vàng và nâu.
Hình 1: Cột 1 – cắn dịch chiết cyclohexane được chạy sắc ký
Phân đoạn F26 đến F30 thu được từ cột 1 cho thấy 1 vết màu hồng trên bản
sắc ký lớp mỏng (Hình 2), phân đoạn này được kết hợp lại thu được 78,5 mg
ở dạng sirô màu hơi nâu. Phân đoạn F110 đến F155 cho thấy 3 vết màu hồng
trên bản sắc ký lớp mỏng (Hình 3), phân đoạn này được kết hợp lại thu được
1000 mg ở dạng sirô màu hơi nâu. Mọi cố gắng để tách các chất từ 3 vết
(Hình 3) bằng sắc ký cột (cột 2, cột 3, cột 4) bằng các hệ dung môi pha động
có độ phân cực tăng dần, bắt đầu bằng cyclohexane : ethyl acetate = 100 : 0
(v/v) theo sau là sự tăng dần tỉ lệ ethyl acetate 0,5%, 1%, 1.5%, 2% kết quả
không tách được các vết riêng rẽ. Các vết trên TLC của phân đoạn F110 đến
F155 đã được tinh chế theo từng vết bằng sắc ký lớp mỏng chế hoá (TLC
preparative), các vết tách được, được phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton
1
H-nmr và phổ hồng ngoại IR cho thấy thành phần hoạt chất trong
phân đoạn F110 đến F155 có cấu trúc serquiterpene, serquiterpene lactone
(Hình 4.), cấu trúc này phổ biến có trong thành phần tinh dầu của các loài
curcuma khác thuộc họ gừng. Các vết màu hồng trên bản sắc ký lớp mỏng
TLC (Hình 3) được cho là những đồng phân và những dẫn chất có cấu trúc
tương tự nhau.
Hình 2: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn F 26 đến F30 của cột 1
Hình 3: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn F 110 đến F 155 của cột 1
Dùng sắc ký khí (GC) để nghiên cứu so sánh thành phần tinh dầu của củ
thuộc họ gừng thu hái từ Miền Trung Việt Nam với tinh dầu có trong các
loài curcuma thuộc họ gừng đã được biết như là C. Longa, C. Zedoaria, C.
Xanthorrhiza, C. Amada, C. Madias, C, Ducros được lưu trữ tại phòng thí
nghiệm khoa dược, đại học Angers, cộng hoà Pháp, kết quả phổ GC cho
thấy thành phần tinh dầu trong củ thuộc họ gừng của Việt Nam có thành
phần tương tự thành phần tinh dầu trong các loài curcuma đã biết. Đặc biệt,
thành phần tinh dầu của củ thuộc họ gừng thu hái từ Miền Trung Việt Nam
rất giống thành phần tinh dầu của loài C. Zedoaria, tuy nhiên thành phần
hàm lượng có khác biệt.
Phân đoạn F110 – F155 của cột 1 (khối lượng dịch chiết 5 grams, thể tích
mỗi phân đoạn 10 mL, hệ dung môi pha động C, C-E, C-E-M. (với C:
Cyclohexane, E: Ethylacetate, M: Methanol) thu được tại hệ dung môi C-E
(92:8), được bay hơi dung môi, thu được cắn có màu hơi nâu, khối lượng
1000 mg.
Phân đoạn F20 – F24 của cột 1 (khối lượng dịch chiết 5 grams, thể tích mỗi
phân đoạn 10 mL, hệ dung môi pha động C, C-E, C-E-M. (với C:
Cyclohexane, E: Ethylacetate, M: Methanol) thu được tại hệ dung môi C-E
(94:6), được bay hơi dung môi, thu được cắn có màu hơi nâu, khối lượng
136,3 mg.
Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton cho kết quả:
1
H-NMR (δ ppm),
F20-F24-C1 / CDCl
3
7.0 (s) 5.3 (s), 5.1 (s), 3.4 (m), 3.2 (m), 3.1 (q), 2.5 (m),
2.1 (m), 1.8 (m), 1.7 (m), 1.6 (m), 1.2 (m), 1.1 (m), 0.9 (m). Ứng với các cấu
trúc aromatic proton, -CH=, -CH=, CH, CH, CH, CH2, CH2, CH3, aliphatic
protons, CH3, aliphatic protons, CH3, aliphatic protons, CH3, aliphatic
protons, CH3, aliphatic protons, CH3, aliphatic protons.
Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
13
C-NMR (δ ppm), F20-F24-
C1 / CDCl
3
: 149, 137, 122, 114, 48, 39, 30, 17, 18, 9
Phân đoạn F26 – F30 của cột 1 (khối lượng dịch chiết 5 grams, thể tích mỗi
phân đoạn 10 mL, hệ dung môi pha động C, C-E, C-E-M. (với C:
Cyclohexane, E: Ethylacetate, M: Methanol) thu được tại hệ dung môi C-E
(93:7), sau khi bay hơi dung môi, thu được cắn có màu hơi nâu, khối lượng
78,5 mg.
Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
1
H-NMR (δ ppm), F26-F30-
C1 / CDCl
3
: 7.0 (s), 5.3 (s), 5.1 (s), 3.4 (m), 3.2 (m), 3.1 (q), 2.5 (m), 2.1
(m), 1.8 (m), 1.7 (m), 1.6 (m), 1.2 (m), 1.1 (m), 0.9 (m). Ứng với cấu trúc
aromatic proton, -CH=, -CH=, CH, CH, CH, CH2, CH2, CH3, aliphatic
protons, CH3, aliphatic protons, CH3, aliphatic protons, CH3, aliphatic
protons, CH3, aliphatic protons, CH3, aliphatic protons.
Phân tích phổ hồng ngoại F26-F30-C1, dạng sirô màu hơi nâu, IR (KBr
nujol)
max
: 3503, 3401, 2962s, 2930s, 2873, 1767s, 1712s, 1455m, 1418m,
1377, 1278, 1134, 752 cm
-1
.
Phân đoạn F110 – F155 của cột 1 (khối lượng dịch chiết 5 grams, thể tích
mỗi phân đoạn 10 mL, hệ dung môi pha động C, C-E, C-E-M. (với C:
Cyclohexane, E: Ethylacetate, M: Methanol) thu được tại hệ dung môi C-E
(92:8), được bay hơi dung môi, thu được cắn có màu hơi nâu, khối lượng
1000 mg.
Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
1
H-NMR (δ ppm), F110-F155-
C1/CD
3
OD, 7.0 (m), 5.9 (m), 5.5 (m), 5.3 (m), 4.6 (m), 3.4 (q), 2.4 (m), 1.8
(m), 1.4 (m), 1.2 (m), 0.9 (m). Ứng với cấu trúc aromatic proton, CH=, -
CH=, -CH=, -CH=, -CH, - CH2, -CH2, -CH3, -CH3, -CH3.
Phân tích phổ hồng ngoại F110-F155-C1, dạng sirô màu hơi nâu, IR (KBr
nujol)
max
: 3415, 2964, 2925, 2852, 1741, 1671, 1645, 1550, 1450, 1383,
1317, 1273, 1193, 972, 892, 756 cm
-1
.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét